AlphaFoldがCRISPR蛋白を再設計し遺伝子編集エラーを削減

CRISPRおよび関連システムに基づく遺伝子編集療法は、編集機構が誤ったDNA配列を改変するオフターゲット効果という持続的な安全性の問題に直面しています。このシステムは3つの主要なコンポーネントで構成されています。標的配列と塩基対結合するガイドRNA、ガイドとゲノムRNA両方と相互作用して特異性を実施するCas蛋白（最も有名なのはCas9）、およびCasが部位を見つけた後にDNAを化学的に改変する別の蛋白質です。課題はガイドRNAが通常約18塩基長で、この配列は約700億塩基内に1回だけ出現すると予想されることです。ヒトゲノムはおよそ30億塩基であるため、その計算によれば、オフターゲットマッチはまれであるべきです。しかし、Cas9はDNAへのグリップを失わずに少数のミスマッチ塩基対を許容でき、許容可能なミスマッチの正確な数と位置は異なるため、どのガイドRNAが危険かを予測することが困難です。

中国の機関の研究者チームは、まず大規模なオフターゲット編集部位のライブラリを構築することでこの問題に取り組みました。改変されたCRISPRシステムを使用してアデニン塩基をイノシンに変換し、修飾を含むDNA断片を単離しました。このプロセスを10種類の異なるガイドRNAで繰り返し、各RNAから多くの改変された断片を分析しました。次に、AlphaFold、蛋白質の折り畳みを予測するために訓練されたAIソフトウェア、蛋白質核酸相互作用と多蛋白質複合体を処理するように更新されたものを使用して、CRISPRシステムがこれらの配列とどのように相互作用したかを調べました。4つのコンポーネント全て（DNA、ガイドRNA、Cas9、塩基改変酵素）を含める最初の試みは失敗しました。AlphaFoldは1つの蛋白質を誤って配置しました。DNA、ガイドRNA、Cas9のみに簡素化することははるかによく機能し、実験データと一致する構造を生成しました。

オンターゲットおよびオフターゲットサイトのAlphaFold出力を比較することで、チームは注目に値するパターンを発見しました。オフターゲットサイトの約3分の2がCas9をわずかに異なる全体的な構造を採用させましたが、95%以上はどのアミノ酸がRNAと接触するかを変更しました。つまり、Cas9は時々その正常な形を保ちながら、その内部のアミノ酸がミスマッチ塩基に適応することを許容しました。AlphaFoldに組み込まれた「接触確率」メトリクス、2つの項目（アミノ酸またはヌクレオチド）が8オングストロム以内に座っている可能性を計算するものを使用して、研究者たちはオンターゲットおよびオフターゲットサイトの接触パターンを比較しました。彼らはこの分析を「ContactSeek」と呼び、オフターゲット結合中に接触をシフトさるCas9内のアミノ酸を特定するために使用しました。これらのアミノ酸が群がる領域に焦点を当てることで、彼らはテストする10個の重要な位置を特定しました。その後、23種類の異なるCas9バリアント、各々がこれらのサイトの1つで異なるアミノ酸置換を持つものを合成しました。

最適なバリアントはマッチした標的部位でワイルドタイプCas9と同様の活性を維持しながら、オフターゲット活性を28%から5%に削減しました。同じアプローチは異なるガイドRNAで機能し、関連するシステムで使用される異なるCas蛋白であるCas12にさえ転送されました。指向進化を通じて開発された他の改善されたCas9バリアントと比較すると、新しく設計されたバージョンは同様またはわずかに優れた活性と特異性を示しました。重要な区別は、これらの変化がより多くの標的全体で広く有効であるのではなく、特定のガイドRNAとミスマッチ組み合わせに対してより具体的である可能性があります。研究者たちは、彼らが特定した個々の変化の一部が、以前に開発されたCas9バリアントの改変と潜在的に組み合わされ得ることに注意してください。ただし、彼らはこの組み合わせをテストしていません。彼らは、その方法が既知のオフターゲットイベントを防ぐために遺伝子編集システムを調整するための一般的なアプローチを表しており、遺伝子編集を超えた蛋白質DNA相互作用を微調整するための幅広い応用を持つ可能性があることを示唆しています。

遺伝子編集療法は根本的な安全性の課題に直面しています。ガイドRNAは特定の標的配列に合わせるように設計できますが、ヒトゲノムは十分に大きく、まれなDNA配列でさえ偶然に出現します。これらの配列に結合するCas9蛋白は、その能力を失うことなく、ガイドRNAとDNA間のいくつかのミスマッチを許容することができます。このミスマッチ耐性は位置と数によって異なり、どのガイドRNAがオフターゲット編集を引き起こすかを事前に予測することが困難です。研究者たちは複数のルートでこれに対処してきました。ガイドRNA選択の最適化、指向進化を通じた改善されたCas蛋白の構築、そして現在、AIを使用してミスマッチ耐性を可能にする正確な構造的特徴を特定することです。

チームのイノベーションは、AlphaFoldを蛋白質構造を視覚化するためだけでなく、オンターゲット対オフターゲットサイトで形成された構造を体系的に比較するために使用することでした。DNAの配列がミスマッチしているときのRNA接触パターンが変わるアミノ酸を追跡することで、一貫して適応する位置の小さなセットを特定しました。マッチと不一致シナリオの接触確率出力を比較する「ContactSeek」方法は、候補アミノ酸のリストを高影響サイトの焦点を絞ったセットに変えました。これにより迅速なテストと成功した再設計が可能になりました。注目すべきことに、結果として得られたバリアントは公開文献内の他の構築されたCas9バリアントと同様のパフォーマンスを発揮し、その方法が孤立した利益ではなく本当に競争力のある改善をもたらすことを示唆しています。

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