AlphaFoldでCRISPRタンパク質を再設計、オフターゲット編集を28%から5%に削減

遺伝子編集療法は医学における大きな進歩を表しているが、その開発は持続的な安全性の問題によって制約されてきた。オフターゲット効果である。ヒトゲノムは約30億塩基を含んでいるため、1つの標的配列のみに一致するよう設計されたガイドRNAでも、偶然に類似性を共有する意図しない場所に結合することがある。ガイドRNAと標的DNAの両方を認識し、塩基対形成ルールを通じて特異性を強制するCas9タンパク質は、不一致塩基を許容することができ、これは現在のシステムの精度を制限する特性である。治療は一般的に多くの細胞を編集する必要があるが、この許容性は、規模を拡大するとオフターゲット編集が不可避になることを意味する。

中国の様々な機関に拠点を置く研究チームは、人工知能を使用してこれらの問題のあるオフターゲット相互作用を可能にするCas9タンパク質の部分を特定することに乗り出した。彼らは、DNA塩基アデニンをイノシンに変換する修正CRISPRシステムを使用してオフターゲット編集部位の大規模なライブラリを作成し、10種類の異なるガイドRNAにわたってこれらの修正を含むDNA断片を分離して分析することから始めた。次に、彼らはAlphaFold（タンパク質と核酸の複合体を扱うように更新されたAIタンパク質折り畳みソフトウェア）を使用して、CRISPRシステムがこれらの配列とどのように相互作用するかをモデル化した。最初は完全な複合体（DNA、RNA、Cas9、および修正酵素）をモデル化しようとしたとき、AlphaFoldは1つのタンパク質を誤って配置した。彼らは入力を単純化して、DNA、RNA、およびCas9のみに焦点を当てた。これは配列特異性を決定する主要な因子である。これにより、実験的に決定されたものと一致する構造が生成された。

オンターゲットとオフターゲット部位からの構造を比較することで、研究者らは重要なパターンを特定した：オフターゲット部位の約3分の2がCas9にわずかに異なる全体的な形状を採用させたが、95%以上がRNAと接触するアミノ酸を変更した。AlphaFoldの「接触確率」メトリック（2つの分子成分が互いに8オングストローム以内にある可能性）を使用して、彼らはContactSeekと呼ばれる計算ツールを開発し、不一致が存在するときにCas9内のどのアミノ酸がそれらの相互作用をシフトさせるかを正確に特定した。その後、これらのシフトしたアミノ酸がクラスタ化した領域に焦点を当て、これらの領域が不一致塩基対に対応するために適応していると推論した。

研究者らは特定された10個の主要な位置で23種類の異なるアミノ酸交換をテストした。結果として得られた1つの変異体は、意図した標的での正常な活性を維持しながら、オフターゲット活性を28%から5%に低下させた。同様の改善は異なるガイドRNAで達成され、アプローチは遺伝子編集タンパク質である別のタンパク質Cas12でも機能した。有向進化を通じて開発されたCas9変異体と比較すると、新しい設計は同等またはわずかに優れた活性と特異性を示した。研究者らは、彼らのアプローチは、すべてのシナリオにわたって普遍的に有効なものではなく、特定のガイドRNAと不一致の組み合わせに特化した変更をもたらす可能性があると指摘した。また、彼らの方法を通じて特定された個々の修正は、潜在的には以前に開発されたCas9変異体と組み合わされ、さらに大きな安全性の改善を達成する可能性があることを示唆しているが、これはテストされていなかった。この研究は、既知のオフターゲットイベントを防ぐために遺伝子編集システムを設計するための一般的な方法を説明し、治療開発のボトルネックに対処する可能性があり、遺伝子編集を超えたタンパク質DNA相互作用の最適化のためのより広い応用がある可能性がある。

遺伝子編集療法は、CRISPRシステムが初めてヒト使用に適応させられて以来、根本的な安全性上の課題に直面してきた。ガイドRNAは意図した標的配列のみに一致するように設計されているが、ヒトゲノムの膨大なサイズ（約30億塩基）により、稀な配列さえランダムに複数回出現する可能性がある。さらに問題なのは、Cas9タンパク質が少数の不一致塩基対を許容でき、それでもDNAへの結合能力を失わないため、どのオフターゲット配列が切断されるかを予測することが難しいことである。研究者らはこれに対処するためにさまざまな戦略を追求してきた。ガイドRNA選択の最適化、Cas9タンパク質自体の改善、実際のDNA変更を行う効果タンパク質の修正である。この新しい研究は計算手法を採用し、AlphaFoldがタンパク質と核酸の相互作用をモデル化する能力を活かして、オフターゲット結合を可能にするCas9の正確な構造的特性を特定している。

このアプローチが特に価値がある理由は、その特異性と一般性である。不一致を含む配列に結合する際のCas9の構造変化を分析することで、研究者らはアミノ酸が予測可能な方法で接触パターンを変えることを発見した。これにより、特定の位置でアミノ酸を交換する標的化された修正を設計することが可能になり、オンターゲット性能を失うことなくオフターゲット活性を劇的に低下させた。この方法がCas9とCas12の両方で機能したという事実は、他の遺伝子編集システムにも適用できる可能性を示唆している。他の研究チームは有向進化を使用して同等またはわずかに優れた結果を達成しているが、この計算手法は特定のガイドRNAと既知の不一致パターンに適応したシステムを設計する可能性を提供し、遺伝子治療開発における個別化された安全性の最適化への道を開く。

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